Estudió ingeniería a los 14 años, luego estudió biología y por último fue aceptada en la Facultad de Medicina de la Universidad de Roma "La Sapienza". Su padre se opuso al principio pero a pesar de ello terminó graduándose en 1896 como la primera mujer médico en Italia. Fue miembro de la Clínica Psiquiátrica Universitaria de Roma. Más tarde, estudió antropología y obtuvo un doctorado en filosofía, época en la que asistió a uno de los primeros cursos de psicología experimental. Es contemporánea de Freud y desarrolló su propia clasificación de enfermedades mentales.

Colegio Montessori en los Países Bajos, 1915. Fotografía recogida en el libro "Van Holkema & Warendorf's Uitgevers Mij", Ámsterdam, 1916, que trata sobre el método Montessori.

Cuando se unificaron las provincias italianas y se independizó Italia, hubo un deterioro en la situación económica del país. En ese momento, se interesa por las condiciones sociales, especialmente de las mujeres. Participa en dos congresos internacionales para mujeres: uno celebrado en Berlín en 1896 y otro en Londres en 1900. Habló de las mujeres y de los niños, enfatizando las repercusiones que las condiciones de vida tienen sobre la sociedad. En 1898, en un congreso en Turín expuso la importancia de la educación y atención a niños con deficiencias mentales y planteó la relación entre el abandono infantil y el desarrollo posterior de la delincuencia.

Entre 1898 y 1900 trabajó con niños considerados perturbados mentalmente. Se dio cuenta de que estos niños tenían potencialidades que, aunque estaban disminuidas, podían ser desarrolladas y que eran dignos de una vida mejor sin representar una carga para la sociedad. En este momento decidió dedicarse a los niños por el resto de su vida. Observó a los niños de una institución para niños “ineducables” jugando con las migajas de la comida, porque no había ningún objeto más en el sitio. Vio que no se las comían, sino que las manipulaban y se dio cuenta de que lo que les hacía falta eran objetos para tocar, que el ser humano tiene necesidad de actividad, de realidad, de cultivar su inteligencia y personalidad. 

Montessori, al desarrollar su labor pedagógica, descubrió los trabajos de dos médicos franceses: Jean Itard (1774- 1838) y Eduardo Séguin(1812- 1880). El primero de estos es considerado el "padre" de la nueva pedagogía, que establece la importancia de la observación en los niños y entiende que a los niños no se les puede imponer nada y el segundo creó ejercicios y materiales para ayudar al niño a desarrollar sus facultades, además de estudiar el caso del denominado niño salvaje de Aveyron). Más tarde, conoció los trabajos del pedagogo suizoJohann Heinrich Pestalozzi (1746- 1827). Pestalozzi hacía énfasis en la preparación del maestro, que primero debe lograr un cambio en su persona y debe tener amor a su trabajo. También debe haber amor entre el niño y el maestro.